外周血单个核细胞（PBMC）
PBMC简介
在实验中，尤其是与免疫相关的实验，我们经常会接触到PBMC，PBMC就像是一个金库，收纳了各种各样的宝藏。接下来的几期我想推出PBMC系列话题，和大家分享有关PBMC的各种知识与实验操作，借以将PBMC研究中的难题逐一攻克，帮助大家更好地了解PBMC这个熟悉而又神秘的刺客。
知己知彼，才能百战不殆。要想攻克PBMC这个大难关，我们首先对其要有充分的认识。接下来，我先来给大家讲讲PBMC。
外周血单个核细胞（PBMC）来源于骨髓中的造血干细胞（HSC），HSC通过造血过程可以产生免疫系统的所有血细胞。HSC可以分化为两个谱系：髓系（单核细胞、巨噬细胞、粒细胞、巨核细胞、树突状细胞、红细胞）和淋巴系（T细胞、B细胞、NK细胞），如图1。
图1 造血干细胞分化图
PBMC中约70-90%是淋巴细胞，其中大部分T细胞处于naïve（已经成熟但是未受到抗原刺激的初始）状态。在正常人体中，仅有一小部分T细胞会因为抗原识别而处于激活状态，一旦T细胞被激活就会启动细胞介导的免疫反应。同样地，正常人体中B细胞也大都以naïve或者memory B细胞状态存在，等待抗原的刺激，约占淋巴细胞的5-15%。B细胞激活后，随即分化为浆细胞，后者可分泌大量的抗体，引发体液免疫反应。NK细胞大约占淋巴细胞群的5-10%，是机体先天性免疫的重要组成部分。相比于淋巴细胞，单核细胞的比例则在10-30%左右，在受到刺激之后会分化成树突状细胞或者巨噬细胞。此外，PBMC中还有一部分比例极低的干细胞，大约占0.1-0.2%，因此很难将其从PBMC中分离出来。PBMC中各种细胞的组成和占比见图2。
图2 人PBMCs的组成和占比示意图
有关PBMC的分离，我们已在CD107a：免疫细胞活性评价的又一利器——CD107a 流式检测方法与知识大放送一文中进行过详细地介绍。接下来，就让我们对PBMC中的各个成分进行逐个攻破。
PBMC之——NK细胞
为了更加全面地介绍这些细胞，以下还会涉及部分PBMC以外的内容。
01
NK细胞简介
NK细胞可表达多种膜蛋白，但缺乏T细胞受体（TCR）和B细胞受体，其中CD56（介导同型粘附的粘附分子）和CD16（一种低亲和力Fc受体FcγRⅢ，与NK细胞介导的ADCC效应有关）是NK细胞的表面标志物。根据细胞表面CD56和CD16的表达情况，NK细胞主要可分为两大类：CD56bright和CD56dim。
CD56dim型NK细胞处于完全成熟状态，约占PB-NK细胞的90%，主要介导细胞毒性反应，并且可以通过细胞表面的CD16受体（FcγRIII）参与ADCC效应。CD56dim型NK细胞进表达中等亲和力的IL-2受体β和γ链（CD122/132），并且是NKp44neg和CD117/c-kitneg。
CD56bright型NK细胞则处于未成熟状态，约占PB-NK细胞的5-15%，主要存在于组织和次级淋巴器官中。它们表达高水平的CD56，CD94/NKG2A，NKp44和CD117/c-kit，L-选择素以及高亲和力的IL-2受体α链（CD25），但很少或不表达CD16及杀伤细胞免疫球蛋白样受体（KIRs）。因此，CD56bright细胞的功能主要是分泌细胞因子，如干扰素-γ（IFN-γ）、肿瘤坏死因子（TNF）-α和粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）等。
NK细胞不表达抗原特异性识别受体。NK细胞的表面受体主要分为两类：激活型受体和抑制性受体。两类受体均能识别正常细胞上经典或非经典的人MHC-Ⅰ类分子。其中MHC-Ⅰ类分子与抑制性受体的结合是细胞向NK细胞释放“Do not eat me”的信号，即逃避NK细胞的杀伤作用。
图3 NK细胞表面主要的激活型和抑制型受体[2]
02
NK细胞来源
NK细胞主要有4种来源，分别是外周血，NK细胞系（NK-92），诱导多能干细胞以及间充质干细胞（如脐带血）。NK细胞属于淋巴细胞亚群，无需预先致敏，无需抗体参与即可识别与杀伤肿瘤细胞，并且不具有MHC限制性。实验中常用CD16和CD56作为NK细胞的标志物。以下介绍了临床治疗中不同来源NK细胞的特点与局限性。
（1）外周血（PB-NK）：分离自患者自体或者健康供体的NK细胞。受限于疾病与治疗，患者自体NK细胞功能可能受损，临床更青睐于异体NK细胞，但必须谨慎去除其中的T细胞，以减少GVHD的发生。PB-NK细胞已成熟，无需诱导分化，但基因转导效率相对较低，体外扩增时间延长会导致端粒酶缩短，细胞毒性降低等，同时冻存会降低PB-NK细胞的活力及毒性。NK细胞疗法通常需要回输105-108个细胞/体重（kg），但外周血中NK细胞比例较低，体外大规模培养困难。
（2）脐带血（CB-NK）：“off-the-shelf”，随需随用，冻存耐受。增殖效率较高，可通过建立NK细胞库，即时选取HLA-不匹配产品。其中，CB-NK细胞未分化完全，自然杀伤受体表达相对较低，细胞杀伤能力有限，并且异体移植存在致瘤风险，但同时也具有更强大的骨髓归巢能力。此外，脐血中更高比例的血红蛋白和红细胞会对PBMC的分离以及培养产生影响，在实验过程中需要注意。
（3）干细胞衍生的NK细胞：通常从人胚胎干细胞（hESC）或者诱导多功能干细胞（iPSCs）中诱导NK细胞，扩增周期较长3-5周，可以避免受体与供体之间NK细胞的异质性。但经iPSCs诱导的NK细胞具有潜在的恶性转化能力，在体内存在致瘤风险；同时具有潜在的免疫原性，可能引发非预期的免疫响应。
（4）NK-92细胞系：“off-the-shelf”，随需随用，细胞系扩增以及活性维持方便。NK-92缺少CD16受体介导的ADCC效应，但可以通过修饰获得。NK-92细胞易于进行基因操纵，无需病毒载体，使用电穿孔即可有效导入外源基因。由于NK-92是肿瘤衍生的非整倍体永生化细胞，使用前需要辐照处理，抑制其体内增殖过程，降低了体内的PK以及疗效。
表1 NK细胞来源于优缺点比较[3]
03
NK细胞扩增方式比较
在实验中，我们经常会对NK细胞进行扩增，以研究NK细胞的各种功能及外界刺激对NK细胞介导的免疫的影响。NK细胞扩增的方法多样，主要包括细胞因子扩增、饲养层细胞扩增法，其中IL-2, IL-12, IL-15, IL-18, IL-21以及IFN-γ是NK细胞增殖和发挥细胞毒性的重要调节因子，在体外可以刺激NK细胞的增殖与活性。此外，在NK细胞的扩充中通常还会加入饲养层细胞，常见的如慢性髓性白血病K562细胞（K562细胞经基因改造引入4-1BB配体，膜结合IL-15，膜结合IL-21等可进一步增强NK细胞诱导活性）、经刺激（如OKT-3）的自体PBMC细胞。
表2 NK细胞扩增方式比较[3]
04
两种常见的NK细胞扩增方式
接下来我们来介绍两种实验室常用的PBMC来源的NK细胞扩增方法。
1. K562饲养层细胞+rhIL-2刺激生长
（1）从外周血液样本中分离出PBMC后，通过免疫磁珠法阴选去除CD3+细胞得到CD3dep细胞；
（2）K562经20 μg/mL丝裂霉素C（MMC）预处理2 h作为饲养层细胞（具体处理时间可以根据预实验进行确定）；
（3）调整CD3dep细胞密度为1×107/mL，加入到含饲养层细胞的培养板内（CD3dep细胞：饲养层细胞=3:1），培养基中以100 IU/mL rhIL-2支持成长；
（4）每隔3天更换含100 IU/mL rhIL-2的新鲜培养基；
（5）通过台盼蓝拒染以及流式细胞术检测NK细胞的扩增效率，在9天左右即可获得最大NK细胞扩增数量[4]。
2. PBMC饲养层细胞+rhIL-2刺激生长
（1）从外周血液样本中分离出PBMC后，通过免疫磁珠法阴选去除CD3+细胞得到CD3dep细胞；
（2）以2000 cGy强度γ射线照射分离的CD3+的PBMC（也有直接用全部PBMC的），作为饲养层细胞；
（3）调整CD3dep细胞密度为2×105/mL，加入到饲养层细胞中（NK：饲养层约为1:20），培养基中以10%自体血浆或者5%人AB血清，10 ng/mL OKT-3（刺激辐照后饲养层细胞中的T细胞群）以及1000 U/mL rhIL-2支持生长；
（4）5天后更换含1000 U/mL rhIL-2的新鲜培养基，此后每隔1-2天加入含rhIL-2的新鲜培养基，维持细胞密度在1~2×106/mL；
（5）通过台盼蓝拒染以及流式细胞术检测NK细胞的扩增效率以及进行NK细胞活性评价[5]。
图4 体外NK细胞扩充培养[6]
备注：
①饲养层细胞在加入之前通常会先经过放射线或者丝裂霉素C处理，目的是抑制饲养层细胞的分裂与增殖，但仍保留其代谢活性。
②人白血病细胞株K562和Jurkat通常作为NK细胞毒性评价的参照细胞。其中K562不表达MHC-Ⅰ类分子；Jurkat细胞高表达NKG2D配体等NK细胞激活因子（尽管Jurkat细胞高表达MHC-Ⅰ类分子），也对NK细胞敏感。
③NK细胞活性分析：穿孔素、颗粒酶、对靶细胞的杀伤能力、CD107a、NK细胞表面激活受体（KAR）变化等。
补：PBMC来源的不同NK细胞扩增方法，具体实验步骤参考文献[1]
（1）单种细胞因子扩增
（2）细胞因子混合物扩增
（3）细胞因子+饲养层细胞联合扩增
（4）细胞因子混合物+抗体或者其它试剂扩增
05
NK-92细胞系
NK-92细胞是Gong等人于1992年从一位非霍奇金淋巴瘤患者外周血淋巴细胞中分离出来的，依赖于IL-2的无限增殖NK细胞系。NK-92表型为CD56+CD3-CD16-，因此不具备由CD16介导的ADCC作用。同时，NK-92细胞缺乏杀伤细胞免疫球蛋白样受体（KIRs），但仍具有穿孔素-颗粒酶途径介导的细胞杀伤能力。与NK细胞类似，无需抗原激活，NK-92可直接杀伤被病毒感染的细胞以及肿瘤细胞。但需要注意的是，NK-92细胞系具有永生性，并且存在EB病毒感染的风险，直接运用于人体存在较高的风险，因此NK-92细胞在使用前通常经γ-放射线照射，缩短半衰期，诱导迟发性凋亡，同时保留其肿瘤杀伤活性。但也因如此，临床治疗需要重复给药，或者需要额外提供IL-2维持NK-92活性，增加临床治疗的风险。
NK-92细胞的体外培养通常需要特殊的培养条件：使用含12.5%马血清，含12.5%胎牛血清的α-最低必需培养基（α-MEM），培养基中添加0.2 mM肌醇，0.1 mM β-巯基乙醇，0.02 mM叶酸以及100-200 U/mL重组IL-2支持生长。
参考文献
1. Fang, F., et al., Advances in NK cell production. Cellular & Molecular Immunology, 2022. 19(4): p. 460-481.
2. Zhang, J., H. Zheng, and Y. Diao, Natural Killer Cells and Current Applications of Chimeric Antigen Receptor-Modified NK-92 Cells in Tumor Immunotherapy. International Journal of Molecular Sciences, 2019. 20(2).
3. Gong, Y., et al., Chimeric antigen receptor natural killer (CAR-NK) cell design and engineering for cancer therapy. Journal of Hematology & Oncology, 2021. 14(1): p. 73.
4. Bae, D.S. and J.K. Lee, Development of NK cell expansion methods using feeder cells from human myelogenous leukemia cell line. Blood Research, 2014. 49(3): p. 154-161.
5. Ahn, Y.-O., et al., Irradiated and activated autologous PBMCs induce expansion of highly cytotoxic human NK cells in vitro. Journal of Immunotherapy (Hagerstown, Md. : 1997), 2013. 36(7): p. 373-381.
6. Lim, O., et al., GMP-compliant, large-scale expanded allogeneic natural killer cells have potent cytolytic activity against cancer cells in vitro and in vivo. PloS One, 2013. 8(1): p. e53611.
7. Becker PS, Suck G, Nowakowska P, et al. Selection and expansion of natural killer cells for NK cell-based immunotherapy. Cancer Immunol Immunother. 2016;65(4):477-484. doi:10.1007/s00262-016-1792-y
8. StemExpress：https://www.stemexpress.com/blogs/peripheral-blood-mononuclear-cells/
9. Zhang L, Meng Y, Feng X, Han Z. CAR-NK cells for cancer immunotherapy: from bench to bedside. Biomark Res. 2022;10(1):12. Published 2022 Mar 18. doi:10.1186/s40364-022-00364-6
