CD107a：免疫细胞活性评价的又一利器——CD107a 流式检测方法与知识大放送
在流式细胞术评价细胞免疫功能的文章中，我们经常会看到CD107a指标，那么究竟CD107a是哪路神仙？为什么可以用来评价免疫细胞的杀伤毒性？以及我们如何通过流式细胞术检测CD107a？如果读者的研究方向与细胞溶酶体或者自噬有关，那么大名鼎鼎的溶酶体相关膜蛋白（Lysosome-associated membrane protein-1，LAMP1）你肯定听过，LAMP1在溶酶体膜稳定性维持中具有重要作用，它也是溶酶体抵抗自身水解酶自我攻击的重要保护机制。没错，CD107a其实就是LAMP1，惊了个呆，看似毫无联系的两个东西竟然是同一个东西。那么接下来，请听小生我细细道来？
何为CD107a
我们都知道，NK细胞主要是一类溶解性免疫细胞，它杀伤靶细胞的主要机制依赖于一个称为“脱颗粒”的过程。因此在NK细胞的胞浆中储存着大量预先合成的细胞溶解性颗粒，这些颗粒中含有多种不同的蛋白，包括穿孔素（perforin）、颗粒酶（granzyme）、组织蛋白酶（cathepsin）等。当NK细胞在外周中穿行遇上靶细胞后，会与靶细胞之间形成免疫突触，随后这些颗粒会将其内容物释放到免疫突触中，导致靶细胞裂解。同样地，T细胞在接受TCR信号刺激活化后也会迅速脱颗粒，通过T细胞和靶细胞之间的免疫突触释放细胞溶解性颗粒。
LAMP-1，也就是CD107a，是一种存在于溶酶体中的高度糖基化跨膜蛋白。在NK细胞和细胞毒性T细胞（CTL）中，CD107a是溶细胞颗粒中最丰富的蛋白质之一，它位于囊泡膜的内侧，其高度糖基化的部分隐藏在腔侧，短尾则暴露于细胞质中，与反式高尔基体产生相互作用，介导蛋白经溶酶体途径的分选[1]。
CD107a可以用来评价NK细胞或者T细胞活性的原因就是：一旦颗粒到达NK/T细胞的浆膜面，颗粒膜与细胞膜发生融合，CD107a随即暴露在细胞膜表面，这被认为是一种保护效应细胞（NK/T细胞）免受脱颗粒相关的自杀机制[2, 3]，可通过特异性抗体标记后进行流式细胞术检测。目前研究表明，CD107a分子的膜表达可以直接反映NK细胞或者CTL的脱颗粒过程，从而反映其杀伤功能。此外，还有大量研究在CD107a的膜表达与NK细胞或者CTL的细胞毒性活性与细胞因子分泌之间建立起了直接的联系，使其成为评估针对各种刺激物（包括肿瘤细胞）的免疫细胞细胞毒性反应激活的可靠检测方法。
此外，CD107a还有两个同胞兄弟，也就是CD107b（LAMP-2）和CD63（LAMP-3）它们均属于同一家族，同样表达在NK细胞、CTL细胞颗粒囊泡表面。但相比于CD107a，NK细胞激活诱导CD107b膜暴露的程度较弱，而CD63的膜表达则与NK细胞激活无明显的相关性。因此不宜用CD107b和CD63来表征NK细胞或者CTL细胞的脱颗粒活性。
CD107a用于评价NK/T细胞细胞毒性的证据
图1 Perforin与CD107a的表达表现出最高程度的相关性[2]
图2 NK细胞激活后高表达膜CD107a分子[1]
注：人白血病细胞株K562通常作为NK细胞毒性评价的参照细胞，K562细胞不表达MHC-Ⅰ类分子，可促进NK细胞激活。PMA/ionomycin（佛波酯/离子霉素）可诱导NK细胞活化，与蛋白转运抑制剂（BFA/Monensin）联合使用，则可使诱导的细胞因子滞留在胞内，有利于后续检测。
图3 CD107a膜表达与NK细胞IFN-γ, TNF-α分泌以及对K562细胞的裂解活性表现明显的相关性[1]
注：该文章中还指出CD107a可能成为比IFN-γ, TNF-α等细胞因子更有效的NK细胞活性指标。CD107a的可检出量较高，在较早期即可出现变化，膜表达动力学变化与NA细胞靶细胞裂解率变化表现出相似性。
CD107a的流式检测方法
以上说了那么多都在强调CD107a可以作为NK细胞以及T细胞活化的检测标志物，接下来我们就来介绍CD107a的流式检测方法。我们以文献[4]中NK细胞CD107a表面表达检测作为例子介绍，该方法同样适用于活化T细胞CD107a的表面表达的检测。
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实验所用靶细胞：人白血病细胞株K562细胞（不表达人MHC-Ⅰ/Ⅱ类分子）
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效应细胞：人PBMC细胞
01
细胞培养
K562细胞培养条件：K562细胞用25 cm2或者75 cm2的细胞培养瓶置于37℃，5%CO2条件下培养，每隔2-3天补液处理，维持细胞培养密度在106/mL左右，一周左右离心换液。
02
PBMC分离
（1） 新鲜的人外周血样（肝素抗凝）用1×PBS按照1:1的比例进行稀释。
注：血液的新鲜程度影响PBMC的分离效果，尽量在采集24 h以后进行PBMC分离以维持其较高的活性。稀释血液可以降低血液粘稠度以及红细胞的聚集，提高单个核细胞的收获量。
（2）取预热的淋巴细胞分离液15 mL加至50 mL离心管中待用，小心沿管壁加入35 mL稀释后的血液，使稀释血液重叠于分离液上方。
注：分离液使用前需提前预热至室温（18-25℃），温度过低会导致淋巴细胞丢失过多，温度过高则影响淋巴细胞活性。分离液应直接加至离心管底部，切忌浸润四周管壁，加入细胞悬液则不能扰乱两者界面以影响分离效果。根据血液样本量大小，选择合适体积的离心管，一般稀释血液与分离液的体积比为2:1~3:1。
（3）室温条件下2000 rpm离心20 min，避免振摇。密度梯度离心后，离心管内分成四层，从上往下分别是：顶层主要是血浆；白色云雾状层为PBMC；分离液层；最底部是红细胞和粒细胞。见图4。
注：分离的转速和时间需要根据不同样品做出调整，离心后若白色云雾层中还掺杂红细胞，则需要提高转速或者延长离心时间；若淋巴细胞丢失过多，则需要降低转速或者离心时间。
（4）小心吸取中间白膜状的单个核细胞层于另一15 mL的离心管中，加入10 mL 1×PBS充分混匀。
注：一般加入5倍以上体积的1×PBS进行洗涤。
（5）室温条件下1500 rpm离心10 min，弃上清，再用1×PBS洗涤细胞2-3次。
（6）用10 mL预热的完全培养基充分混匀细胞，取少量细胞进行计数，并通过台盼蓝染色计数死（活）细胞。
（7）调整PBMC细胞密度至2×106/mL，置于37℃，5%CO2条件下培养，有必要时以100 U/mL的IL-2支持生长。
图4 淋巴细胞分离液离心后细胞的分层情况[4]
03
PBMC+靶细胞共培养
（1）K562和PBMC细胞（也可用IL-2激活的纯化的NK细胞作为效应细胞）计数。
（2）PBMC在200 g室温条件下离心5 min，随后用预热的新鲜培养基调整细胞密度至2×106/mL左右。将PBMC分成两份，一份加入浓度为10 μg/mL 的人anti-NKG2D抗体，另一份加入IgG作为同型对照抗体。置于37℃，5% CO2恒温培养箱中孵育1 h，随后用1×PBS洗涤PBMC，离心除去未结合的抗体。
（3）阳性对照培养基配制：配制含 100 ng/mL PMA以及2 μg/mL ionomycin（用于NK细胞激活的阳性对照）的完全培养基。
注：新鲜配制的PMA和ionomycin分装后置于-20℃避光保存，避免反复冻融。两者的工作浓度分别为50 ng/mL和1 μg/mL。
（4）洗涤后的PBMC和K562细胞均在200 g室温条件下离心5 min，调整PBMC细胞密度至107/mL，K562细胞密度至106/mL，即控制效靶比在10:1。
注：具体的细胞密度或者效靶比可根据预实验结果做出灵活调整。
（5）96孔细胞培养板中每孔各加入两种细胞悬液100 μL，人anti-CD107a抗体10 μL，置于37℃，5% CO2恒温培养箱中孵育4 h。
（6）在孵育1 h时，配制monensin溶液（将2 μL GolgiStop加入到75 μL完全培养基中），96孔板每孔加入5 μL，充分混匀。
注：BD GolgiStop™ 添加剂是一种蛋白转运抑制剂，含有monensin，可在体外或体内刺激淋巴细胞，阻断胞内运输。最后导致高尔基复合体中积聚细胞因子和/或蛋白质。
（7）孵育4 h结束后，将96孔细胞培养板中的混合物转移至5 mL流式管中，用PBS洗涤细胞两次，室温400 g条件下离心5 min。
（8） 配制抗体混合液：每个流式管配制抗体混合液100 μL，取5 μL 人anti-CD3抗体，5 μL人anti-CD56抗体加入至90 μL的PBS中。（9）将离心后的细胞用100 μL的抗体混合液重悬，轻轻用移液枪混匀，室温条件下避光孵育25 min。
（10）孵育结束后，用PBS洗涤细胞一次，室温400 g条件下离心5 min。去除上清后用300-400 μL的PBS重悬，立即用流式细胞术检测，待测样品置于冰上避光保存。
实验组别设置
结果分析：
图注：以FSC-A和SSC-A参数画门（P1）圈出有活性的PBMC细胞，以CD3-CD56+画门（P2）圈出NK细胞，对P2门内细胞进行CD107a阳性表达分析。
图注：用NKG2D抗体阻断NK细胞表面的NKG2D（NK细胞激活型受体）明显降低了NK细胞的脱颗粒活性。
写在最后，以上实验是笔者本人根据参考文献进行梳理和总结的，受限于本人知识的局限性，文中难免存在疏漏，还望各位学者海涵，不吝赐教。
参考文献
1. Alter, G., J.M. Malenfant, and M. Altfeld, CD107a as a functional marker for the identification of natural killer cell activity. Journal of Immunological Methods, 2004. 294(1-2): p. 15-22.
2. Cohnen, A., et al., Surface CD107a/LAMP-1 protects natural killer cells from degranulation-associated damage. Blood, 2013. 122(8): p. 1411-1418.
3. Aktas, E., et al., Relationship between CD107a expression and cytotoxic activity. Cellular Immunology, 2009. 254(2): p. 149-154.
4. Lorenzo-Herrero, S., et al., CD107a Degranulation Assay to Evaluate Immune Cell Antitumor Activity. Methods In Molecular Biology (Clifton, N.J.), 2019. 1884: p. 119-130.
