NK细胞疗法未来方向，肿瘤缓解后的巩固候选方案

免疫疗法作为一种创新的癌症治疗方法在世界范围内引起了广泛关注。免疫治疗策略的核心是通过增强患者的免疫系统来消灭肿瘤细胞。作为免疫系统的重要组成部分，免疫效应细胞，尤其是自然杀伤细胞（NK）和T细胞的数量和活性，与机体的抗肿瘤能力密切相关。因此，基于T或NK细胞的过继转移策略为淋巴瘤、白血病、黑色素瘤、肺癌、结直肠癌等晚期恶性肿瘤患者提供了新的希望。

80年代，Rosenberg和他的团队首先证实用自体肿瘤浸润淋巴细胞 (TIL) 和 IL-2治疗转移性黑色素瘤患者可以实现客观消退。从那时起，随着效应细胞来源的增加以及增强特异性的工具（例如工程特异性T细胞受体 (TCR) 和嵌合抗原受体）的增加，基于过继细胞转移的免疫治疗方法取得了显着进步。

NK细胞作为人体免疫系统的“第一道防线”，无需抗原预致敏和主要组织相容性复合体（MHC）限制，可直接识别并快速杀伤靶细胞。与T细胞相比，NK细胞的重要特征之一是缺乏TCR（同种异体T细胞激活的主要机制之一）。NK细胞的抑制性受体，如KIR，也能阻止NK细胞攻击正常宿主细胞。因此，由于诱导移植物抗宿主病 (GvHD) 的可能性要小得多，NK细胞被认为对ACT更安全。此外，NK细胞的这些特性使得它们可以由任何健康的供体提供，这打破了基于T细胞的 ACT 的限制并降低了大规模生产的成本。

这些特性使NK细胞成为过继免疫疗法“现成”治疗产品的理想候选者。具体而言，自体或同种异体NK细胞在饲养细胞如基因修饰的K562细胞和细胞因子（IL-2/IL-15）的刺激下在体外扩增和激活，然后回输给患者以消除肿瘤细胞。过继性NK细胞疗法的快速发展领域现在涵盖了一系列候选细胞来源，并且随着基因工程的进步进一步提高了NK细胞的特异性、持久性和抗肿瘤功效。

1. NK细胞的生物学特性

NK 细胞是重要的免疫效应细胞，属于先天性淋巴样细胞 (ILC) 家族。NK细胞最初因其对癌细胞的自然杀伤活性而得名。在发育过程中，NK 细胞源自与T 细胞和B细胞相同的常见淋巴祖细胞 (CLP)。根据CD56和CD16表达密度的不同，人类NK细胞可进一步分为两个特征明确的亚群：CD56 ^bright CD16^-和CD56 ^dim CD16⁺。前者主要存在于次级淋巴组织中，其功能主要是产生细胞因子，包括干扰素-γ（IFN-γ）、肿瘤坏死因子（TNF）、IL-10、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF) 。相比之下，CD56 ^dim CD16⁺子集约占外周血 (PB) 中所有NK细胞的90%，介导更高的基线穿孔素的表达和更强的天然细胞毒性。

尽管NK 细胞缺乏特异性区分抗原的体细胞重排受体，但它们天生就表达多种激活、共刺激和抑制受体。这些受体之间的动态平衡确保了NK细胞细胞毒活性的精细调节（图1）。当激活信号强于抑制信号时，NK细胞被激活；否则，他们处于宽容状态。

2. NK 细胞的效应器功能

（1） 抗肿瘤功能

NK细胞可首次启动肿瘤免疫防御功能，对异常（病理或恶性）细胞做出快速反应。作为具有强大抗癌活性的“战士”，NK细胞主要通过直接杀伤、抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用（ADCC）和分泌细胞因子发挥作用。

细胞毒作用（ADCC）是NK细胞的另一个强大的抗肿瘤功能，各种临床开发的单克隆抗体 (mAb)，如利妥昔单抗、西妥昔单抗和英夫利昔单抗，均为利用NK细胞的这种机制发挥其抗肿瘤作用。

此外，活化的NK细胞还通过合成和分泌多种细胞因子与其他免疫细胞相互作用，包括 IFN-γ、TNF、淋巴趋化因子 (XCL1)、CC 趋化因子配体（CCL3、CCL4 和 CCL5）、IL-10、IL-13 GM-CSF，从而调节机体免疫功能。

在免疫编辑过程中，恶性细胞演化出各种策略来逃避NK 细胞攻击并形成转移，例如上调抑制性配体和下调激活性配体、分泌介导激活性配体脱落的金属蛋白酶，或将NK细胞重新编程为促进转移的细胞状态 。NK细胞在肿瘤或慢性感染下也存在免疫衰竭状态。这些细胞通常表达细胞衰竭的标志物，例如PD-1、CD96、TIGIT 、NKG2A 和Tim。此外，它们产生细胞毒性因子（IFN-γ、颗粒酶、穿孔素）的能力显着下降。

迄今为止，四种靶向CD19的CAR-T细胞产品和一种靶向BCMA的CAR-T细胞产品已获得FDA批准申请。尽管如此，CAR-T治疗领域仍面临诸多挑战：（1）高水平的促炎细胞因子易导致免疫细胞相关神经毒性（ICANS）和细胞因子释放综合征（CRS），具有严重的危及生命的毒性; (2) HLA壁垒限制了大规模生产的细胞来源；(3) 抗原逃逸诱发治疗耐药和复发；(4) 实体瘤的迁移和侵袭受限。

NK细胞因其稳定性和安全性等优势而受到越来越多的关注。NK细胞通常采集自患者或健康志愿者，并在体外经过一系列过程，包括纯化、激活和扩增、质量控制，并最终输注到患者体内。这些NK细胞产品不仅可以直接在体内杀死靶细胞，还可以通过激活和/或增强机体免疫力来控制癌症的复发和转移。近年来，研究人员致力于优化NK细胞的来源和功能，尤其是随着基因工程的进步，使NK细胞成为ACT领域中独特而有前途的治疗工具（图2）。

图2. 基于自然杀伤 (NK) 的过继细胞疗法 (ACT) 的示意图。用于过继输注的NK细胞来源广泛，包括外周血NK (PB-NK) 细胞、脐带血NK (UCB-NK) 细胞、NK 细胞系和诱导多能干细胞 (iPSC) 衍生的NK细胞。

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来源：参考资料 [1]

为了产生足够和高质量的NK细胞，用于免疫治疗的细胞来源已经大大丰富，包括PB-NK（成人外周血），UCB-NK（脐带血NK），NK细胞系和诱导多能干细胞衍生的NK （图2）。

外周血（PB-NK）

自体或同种异体PB是NK ACT中最常用的细胞来源。I期临床试验表明，自体NK细胞（扩增和活化）可通过曲妥珠单抗介导的ADCC对HER2阳性恶性肿瘤表现出初步的抗肿瘤活性。然而，对于癌症免疫疗法，自体NK细胞通常会因自身HLA -I类水平而耗尽或受损。相反，由于KIR-HLA不相容性，同种异体PB-NK显示出更强的肿瘤杀伤能力。

在一系列细胞因子刺激下，NK细胞表现出类似于T细胞和B细胞的记忆样特性。PB-NK细胞被IL-12、IL-15和IL-18的组合短暂预激活，在细胞因子或K562白血病细胞再刺激后表现出更强的IFN-γ反应。作为ACT中有前途的细胞来源，细胞因子诱导的记忆样NK(CIML-NK) 在NK耐药淋巴瘤和黑色素瘤的抗肿瘤反应中取得了巨大成功，并有效地诱导了一些白血病患者的完全缓解。

脐带血（UCB-NK）

与PB-NK不同，UCB中的NK 细胞更丰富（占淋巴细胞的 30%）、增殖能力强且易于收集。目前的平台已经能够在2周内扩增出高纯度 (>99.9%) 的临床级UCB NK细胞，并用于癌症免疫治疗。经过长期冷冻保存，UCB-NK细胞的扩增效率和细胞毒性完好。在用细胞因子（IL-2和IL-15）刺激后，UCB-NK显着上调NKp46的表达，实现与同等处理的PB NK细胞相当的裂解活性。当与经γ照射的PLH饲养细胞一起培养时，观察到UCB-NK细胞比PB-NK细胞对原代MM细胞具有更大的细胞毒性。此外，与抗体疗法的结合也促进了 UCB-NK细胞在免疫缺陷小鼠肿瘤床中的浸润。

NK细胞系

NK细胞系，如NK-92、KHYG-1、YTS、HANK-1和NKL，是基于NK的免疫疗法的有吸引力的来源。NK细胞系的主要优点是它们可以很容易地培养、扩增和基因编辑。NK-92 分离自一名 50 岁男性非霍奇金淋巴瘤患者，已在I 期临床试验中进行测试。由于NK-92是肿瘤来源的，因此在给药前必须进行辐照以确保其安全性。NK-92还经过CAR 基因工程改造，可在临床前研究中治疗多种癌症，包括黑色素瘤、高危横纹肌肉瘤和淋巴瘤。

最近，已开发出 NK-92 细胞来表达嵌合修饰的 CD16 受体，以增强对肿瘤细胞的裂解功效。与来自原代人类供体的 CAR NK 相比，CAR NK-92 细胞分泌更多的颗粒酶A和IL-17A。它们对白血病细胞的更强细胞毒性也会导致健康细胞的破坏。NK-92的改良版NK-92MI（不依赖IL-2）因其出色的扩增能力和细胞毒性而在各种癌症治疗中得到探索。

干细胞衍生的NK

“现成”产品开发的另一个理想候选者是干细胞衍生的NK细胞。诱导多能干细胞 (iPSC) 衍生的NK细胞有几个优点，例如产生同质的NK细胞群、NK细胞的无限来源和强可塑性。iPSC-NK 细胞通常用于克隆水平的基因编辑，以提高NK细胞的抗肿瘤活性。

总的来说，在迄今为止的试验中，将PB衍生的NK细胞扩增到足够的细胞剂量是费时费力的。NK细胞系可能会诱发细胞毒性和排斥反应。相比之下，UCB或iPSC衍生的NK细胞能够充分离体扩增并且是安全的，展示了未来临床应用的治疗潜力。

基因工程

基因工程技术一般是指对基因进行一系列人工改造，以创造新的遗传特性。最近，已经测试了多种基因工程方法来优化NK细胞的抗肿瘤活性，并为癌症患者提供更好的过继性NK细胞疗法。目前，对NK细胞的基因工程改造主要包括用CAR或其他结构武装NK细胞，以提高NK细胞的功效和特异性（图3和图4）。

图3。基于嵌合抗原受体 (CAR) 的修饰。功能性 CAR 分子通常由抗原结合结构域、跨膜区域和细胞内信号结构域组成。细胞外结构域包含与肿瘤抗原结合的单链可变片段 (scFv)。传统的CAR受体分为三代。在第一代CAR结构的基础上，通过在胞内部分加入一个或两个共刺激分子，形成了增强增殖和杀伤能力的第二代和第三代CAR。CAR分子赋予NK细胞特异性识别肿瘤抗原的能力，并将激活信号传递给NK细胞，从而引发肿瘤细胞裂解。CAR改装的发展主要有两个重点：识别不同的肿瘤抗原并应对各种挑战。针对不同肿瘤抗原的 scFv 结构赋予 CAK-NK细胞针对多种恶性肿瘤的不同特异性。趋化因子受体 (CXCR) 或 IL-15 的共表达可进一步促进CAR NK 细胞归巢至肿瘤部位或改善其体内持久性。靶向抑制性受体 PD-1或抑制性配体（B7-H3和HLA-G）提供了克服免疫抑制性肿瘤微环境 (TME) 的有效方法。

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来源：参考资料 [3]

图4。其他先进的基因改造策略。

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来源：参考资料 [3]

多种基因修饰策略进一步增强了CAR NK的特异性和非特异性细胞毒性、归巢和浸润能力、体内持久性以及对免疫抑制的抵抗力。根据细胞内激活信号的数量，常规CAR受体可分为三代（图3）。

其他更先进的CAR结构正在设计和测试以优化抗癌治疗效果，例如增加细胞因子的表达，同时靶向多种特异性抗原，使用基于具有高活性的纳米抗体的构建体稳定性和溶解性，或引入新型嵌合共刺激转化受体、NK细胞共刺激结构域和控制输注NK细胞数量以避免毒副作用的自杀基因。

CAR -NK 细胞抗血液恶性肿瘤

作为在B细胞恶性肿瘤中广泛且特异性表达的分子，CD19 是ACT的理想靶标。最早的一项研究表明，携带第二代抗CD19 CAR 的原代NK细胞可以克服抑制信号并特异性杀死白血病细胞。然而，在抗 CD19 CAR T/NK 细胞治疗后，一些白血病细胞发生基因突变和CD19 抗原杂合性丢失，导致复发或难治性急性白血病。

CAR-T细胞在T细胞急性淋巴细胞白血病（T-ALL）治疗中的应用由于效应细胞与恶性肿瘤之间存在一些共享抗原而受到限制。如CD5、CD7是恶性T细胞的重要特征标志物，在正常T细胞上也普遍表达。临床前研究表明，抗CD5 CAR NK-92 细胞可能是一种替代治疗策略。

CAR-NK细胞对抗实体恶性肿瘤

最近的一项研究初步评估了靶向人表皮生长因子受体-2 (HER2) 的CAR-NK细胞产品的有效性和安全性。在产品性能方面，HER2 CAR的表达进一步增强了NK细胞对各种表达HER2的肿瘤细胞系的特异性细胞毒性。

与HER2特异性CAR-T不同，CAR-NK引发更可控的细胞因子分泌，并且对表达基础水平HER2的非恶性支气管上皮细胞没有增强的细胞溶解作用。此外，他们观察到一个有趣的现象，即慢病毒转导上调了NK细胞表面营养受体CD71 和CD98的表达，导致其杀瘤能力非特异性增强。

除了基于CAR结构的重定向修饰外，还探索了其他基因工程策略来增强NK细胞的抗癌功效（表2）。这些策略主要集中在两个方面：增强NK细胞的细胞毒性和提高体内持久性（图4）。

增强细胞毒性

基因编辑技术的快速发展为优化NK细胞的细胞毒性提供了多种策略，包括增强ADCC功能、诱导靶标特异性和释放免疫抑制。基于单克隆抗体的免疫疗法，如曲妥珠单抗和利妥昔单抗，给许多癌症患者带来了希望，据报道ADCC是影响其临床疗效的主要机制之一。在人类淋巴瘤全身肿瘤模式下，三只荷瘤小鼠在接受 hnCD16-iNK细胞联合抗CD20单克隆抗体后甚至获得完全缓解并存活超过100天。

为了进一步提升NK细胞对恶性肿瘤的特异性杀伤能力，研究人员进行了一项大胆的创新，即对TCR基因进行基因工程改造，形成基于NK的治疗策略。在一项临床前研究中，TCR-NK-92表现出与T细胞相关的表型、代谢和功能特征，同时保留其NK细胞功能，并在荷瘤小鼠中实现控制肿瘤的生长和转移。

提高持久性

维持NK细胞的活力和数量以提高体内持久性至关重要。过继性NK细胞免疫疗法通常依赖 IL-15或IL-2来支持NK细胞的活力，但这些细胞因子可能具有严重的剂量依赖性毒性。为了尽量减少或避免外源性细胞因子的必要性，最近有研究探索了NK细胞基因工程的新目标。总的来说，基因工程赋予NK细胞优异的细胞毒性和持久性，为NK细胞定向疗法的广泛临床应用奠定了坚实的基础。

作为一种新兴的治疗策略，NK ACT 已在临床上得到积极测试。目前基于NK 的临床试验主要集中在白血病，特别是作为 AML的巩固治疗，AML 是一种常见的造血干细胞恶性肿瘤，具有高度异质性。在过去的几年中，多项研究揭示了 NK细胞输注在AML临床治疗中的安全性和治疗潜力。

当与辐射K562-mbIL-21-41BBL共同培养时，NK细胞在培养2周后从PBMC获得1024倍的临床级扩增效率。这些扩增的NK细胞产品表现出更强的脱颗粒作用，并且在具有持续性或复发性微小残留病 (MRD) 的AML患者中输注后达到约50%的持续缓解。

最新的临床试验表明，在13名复发或难治性AML 患者中，6剂冻存NK细胞的总反应率为78.6%，完全反应率为50%，未观察到严重不良事件。过继性NK疗法在4名并发CNS 疾病的AML患者中引发了有益的局部炎症反应或病变改善。

最近，Katayoun Rezvani的小组进行了一项开创性的临床试验，以评估抗CD19 CAR NK细胞产品对CD19阳性淋巴肿瘤的安全性和有效性。该 I/II 期试验表明，在11名CD19阳性淋巴肿瘤患者中，有7名患者输注CAR -NK细胞可诱导完全缓解，并且所有患者都具有良好的耐受性，没有任何剂量限制性毒性。尽管患者仅接受单次NK细胞输注，但可以观察到CAR-NK细胞在体内的扩增和持续存在至少12个月，这可能在很大程度上受益于IL-15的基因修饰。

总之，通过适当的处理，基于NK细胞的过继免疫疗法是一种安全且有前途的策略，可以补充当前基于综合化疗的白血病治疗方案。

与实体瘤相关的临床试验结果显示，在一项小规模的初步II期试验中，同种异体NK输注联合不可逆电穿孔 (IRE) 疗法在PLC中呈现协同效应，显着减少循环肿瘤细胞并延长患者的中位无进展生存期（15.1个月）和1年总生存期（23.2个月）。

与静脉输注相比，局部区域输注NK细胞似乎更有助于实现实体瘤的免疫浸润。

例如，一项I期研究的早期结果支持，在患有复发性髓母细胞瘤和室管膜瘤的儿童脑室内输注同种异体NK细胞是安全可行的，并且冷冻保存不会损害NK细胞的活性和功能。此外，腹腔内输注NK细胞治疗复发性OC的安全性和毒性也在评估中。NK细胞与曲妥珠单抗联合治疗HER2阳性实体恶性肿瘤的有希望的结果。在这项研究中，所有患者都耐受良好，没有任何严重毒性，19名患者中有6名病情稳定，持续时间超过6个月。

总的来说，临床抗肿瘤方案通常选择NK细胞免疫疗法作为缓解后巩固策略或与其他治疗相结合。大多数基于NK输注的临床试验处于早期探索阶段，但目前的数据表明，NK细胞治疗的安全性优于T细胞，其临床疗效仍需进行更大规模的临床试验研究。

NK细胞具有广泛的肿瘤杀伤作用，不受MHC限制。细胞来源的多样性和最近基因工程的临床前进展，进一步优化了NK细胞在ACT中的潜力。

过继性NK细胞治疗的未来方向是不断优化细胞产物的特性，使其成为安全有效的辅助治疗策略。研究人员正在探索多种先进的基因改造策略，以最大限度地发挥NK细胞治疗多种癌症，尤其是实体瘤的潜力。同时，降低成本和标准化NK制备程序也很重要。